********">2019年漳州古雷港区病媒生物监测方案

　　为贯彻落实《国境口岸病媒生物监测规定》、《国境口岸病媒生物监测方案》等文件要求，组织实施好2019年漳州口岸病媒生物监测专项工作，根据厦门海关《卫生检疫处关于开展2019年度口岸及输入性病媒生物监测工作的通知》(卫检通知〔2019〕1号)》及漳州古雷港区实际情况制定方案如下：

　　一、监测项目：

　　漳州古雷港区不同生境的蠓、蚊类（包括成虫、幼虫）、鼠类（包括与鼠传疾病有关的啮齿动物和鼠形动物）及体表寄生虫（蚤、蜱、螨等）。

　　二、监测范围：

　　1、鼠类监测：海腾码头区域、一德码头区域、联检大楼区域

　　2、蚊类监测：海腾码头区域、一德码头区域、联检大楼区域

　　3、幼虫监测：海腾码头区域、联检大楼区域

　　4、蠓类监测：海腾码头区域、联检大楼区域

　　三、监测时间：

　　1、鼠类监测调查时间：2019年7月—2019年12月，每月中旬监测一次。

　　2、蚊类监测调查时间：2019年7月—2019年12月，每月上、下旬各一次。

　　3、幼蚊监测调查时间：2019年7月—2019年12月，每月中旬一次。

　　4、蠓类监测调查时间：2019年7月—2019年10月，每月中旬监测一次。

　　四、监测要求：

　　监测应使用科学的方法，长期、连续、系统地收集病媒生物，从而获取种类、数量、分布和季节消长等资料，遵循“四定”原则，即“定人员、定时间、定生境和定方法”。

　　定人员：监测周期内，监测人员没有特殊情况不得随意更换。

　　定时间：监测周期、频次和器具布放时间，一经确定不得更改，如遇特殊天气可顺延。

　　定生境：根据国境口岸范围和地貌特点，选择具有代表性生态环境为监测点。在监测周期内，不得随意更改生境。

　　定方法：采用本方案制定的方法。如果边境地区因野外条件限制，可选用适宜该口岸的方法，执行前应将工作方案上报直属局，一经确定，不得更改。

　　五、监测方法：

　　1、鼠类监测方法：

　　{86}鼠笼与墙基垂直平放，鼠笼开口朝向墙面，每次布笼数200个，以地瓜拌香油为诱铒，连续布笼3天，晚放晨收，{93}并将抓获的鼠类送实验室鉴定（记录在《病媒生物监测（鼠类）记录表》）。

　　鼠笼法鼠密度参考控制标准为小于0.5%。

　　鼠密度=（捕鼠总数/有效笼数）x100%

　　2、蚤类监测方法：

　　同鼠类调查同时进行，将捕获鼠及器械放入白布袋，扎紧袋口，置于密闭容器内，用氯仿或乙醚麻醉处理。处理后的鼠体放在白瓷盘上，用梳子或刷子捡蚤，以湿毛笔沾起放入75%酒精中，每只鼠检获的蚤类放入同一试管内，做好唯一性标识，在解剖镜下进行分类计数（记录在《病媒生物监测（鼠及寄生虫）记录表》）。

　　鼠体染蚤率（%）=（染蚤鼠数/捕获鼠数）×100%

　　鼠体蚤指数（个/只）=集蚤总数/染蚤鼠数

　　蚤构成比（%）=（某种蚤数/集蚤总数）×100%

　　3、鼠体寄生蜱类监测方法：

　　同鼠类调查同时进行，检蜱方法同蚤类（记录在《病媒生物监测（鼠及寄生虫）记录表》）。

　　鼠体染蜱率（%）=（染蜱鼠数/捕获鼠数）×100%

　　鼠体蜱指数（个/只）=集蜱总数/染蜱鼠数

　　蜱构成比（%）=（某种蜱数/集蜱总数）×100%

　　4、螨类监测方法：

　　同鼠类调查同时进行，检螨方法同蚤类（记录在《病媒生物监测（鼠及寄生虫）记录表》）。

　　鼠体染螨率（%）=（染螨鼠数/捕获鼠数）×100%

　　鼠体螨指数（个/只）=集螨总数/染螨鼠数

　　螨构成比（%）=（某种螨数/集螨总数）×100%

　　5、蚊类监测方法：

　　采用二氧化碳灯诱法，每月上下旬各监测1次，日落时开始监测，每次监测时长为2小时（记录在《病媒生物监测（成蚊）记录表》）。

　　成蚊参考控制标准为平均密度小于60只/灯·小时。

　　平均密度［只/（灯·小时）］＝捕蚊总数/（诱蚊灯数×2）

　　6、幼蚊监测方法：

　　诱卵器法。设两个监测点，布放集卵器共100个，每月调查一次。各诱卵器间隔不少于10米，连续放置7日，于第4、7日分别检查记录伊蚊监测结果(记录在《病媒生物调查（伊蚊）记录表》)。

　　诱卵器法参考控制标准为诱蚊诱卵指数小于5%。

　　诱蚊诱卵指数［%］＝（阳性诱卵器数/布放诱卵器总数）×100%

　　7、蠓类监测方法：

　　紫外灯诱蠓法：2019年7-10月，每月监测1次，在室外将紫外诱蚊灯悬放在离地高度为1.5米，日落后1小时开灯，收集1小时，扎紧袋口， 带回实验室用氯仿处理后放在白瓷盘上进行分类统计（结果记录在《病媒生物监测（蠓类）记录表》）。蠓类参考控制标准为吸血蠓密度小于2只/（灯·小时）。

　　吸血蠓密度［只/（灯·小时）］=捕获吸血蠓数/（灯数×开灯小时数）

　　六、病媒生物样品的保存和运输：

　　（一）基本要求：

　　病媒生物样品保存、运送中，应做好包装，避免反复冻融、受热、阳光直射和颠簸，防止环境污染和样品受损。样品保存与运送人员应具有相应的生物安全知识，在保存、运送过程中能够采取有效的生物防护措施。保存和运送样品专用工具和设备包括：普通冰箱、低温冰箱、带盖塑料桶、塑料盒、塑料袋、白布袋、生物安全运送箱、样品标签、交通工具及其他工具与设备。

　　1、活体保存：

　　应将活体病媒生物连同采集设备一同放入大小合适的白布袋内，扎紧，于白布袋外明显处加贴上记录该样品唯一性的标签，然后将白布袋放入加贴有生物危害标识的带盖塑料桶内，于专用场所内保存，该场所应避免非工作人员进入，并定期消毒。

　　2、死体的保存：

　　死鼠应装入大小合适的密封塑料袋内，一鼠一袋；其他死体病媒生物可放入装有一定数量柔软缓冲材料的带有螺旋盖的塑料盒内。

　　塑料袋或塑料盒密封后，于其明显处粘贴记录该样品唯一性的标签，再放入另一装有足量吸湿性材料的可密封塑料袋内，密封袋口，完成包装。

　　包装好的病媒生物样品如果在２４ｈ内能够运送的，应于送样前置于４ ℃的普通冰箱内冷藏保存。对于２４ｈ内不送样的，应置于－２０ ℃以下的低温冰箱保存。

　　塑料袋或塑料盒应洁净无菌，且具有水密性和防渗漏功能。贮存病媒生物样品的普通冰箱、低温冰箱和超低温冰箱应为专用，专人保管，并定期消毒。

　　3、活体的运送：

　　应使用专用交通工具，将盛装有活体病媒生物的带盖塑料桶由专人尽快运送至实验室。

　　4、死体的运送：

　　死体病媒生物应使用加贴有生物危害标识的生物安全运送箱盛装运送。箱内应填充有足量的用以固定样品袋的缓冲材料，并配备有足够数量的冷冻冰袋或冰盒。

　　对于样品，如装箱后４ｈ内能够送达至实验室的，箱内温度应保持在４ ℃以下；对于４ｈ内不能送达至实验室的，应将样品置于－３０ ℃冷冻后送样，运送过程中应保证箱内温度保持在０ ℃以下；对于２４ｈ内不能送达至实验室的，则应保证箱内温度保持在－２０ ℃以下。

　　对于样品，则应保证样品装箱后箱内温度于运送过程中保持在－２０ ℃以下。

　　5、运送交接记录：

　　应做好样品运送交接记录，记录内容应包括样品名称、数量、包装状态、交接时间、交接人双方签字等项目。

　　（二）病媒生物样本保存：

　　1、蚊类

　　采集到的蚊类标本，直接放入—20℃或者—30℃冰箱中冷冻25-30分钟（切勿使用乙醚、氯仿等麻醉剂，以保证样本病原体检测的准确性），取出标本放在冰块（可用浅底白瓷盘预先冷冻冰块）上（解剖镜下）进行分类鉴定。分装原则为：中华按蚊等中大型蚊虫每30只；淡色库蚊、白蚊伊蚊等小型蚊虫每30-100只装入1.5mL或者2.0mL离心管中；放入液氮或—80℃低温冰箱中保存。液氮中标本的保存时间不超过6个月；—80℃低温冰箱中标本的保存时间不超过12个月。分类鉴定后的标本并同时制作针插标本每个种2-10只；个别种类标本量较少时，也可在分类鉴定后，保存在液氮或—80℃低温冰箱中备检。

　　2、鼠类

　　采集鼠类的标本包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、膀胱、血液。每种脏器标本（黄豆大小体积即可）应分装在不同的1.5mL离心管中或者0号封口袋中。血液标本采集为血清或血纸条方式。鼠体寄生虫的采集应在活鼠经过乙醚或者氯仿麻醉致死后采集。原则上单个鼠脏器标本分装单个试管，可以保存在液氮或者—80℃低温冰箱中备检。

　　七、口岸病媒生物携带病原检测方法

　　（一）鼠类携带病原体检测

　　1、鼠疫菌

　　生物安全：鼠疫是一种自然疫源性疾病，是以发病急、传播快、病死率高、传染性强为特征的烈性传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病。开展鼠疫检测工作应按照《国境口岸鼠疫检验规程》（SN/T 1280-2003）附录A要求，严格执行生物安全操作。

　　血清学监测：按照《国境口岸鼠疫疫情监测规程》（SN/T 1188-2003）6.2.5要求开展间接血凝试验检验鼠疫F1抗体，不明原因死鼠和腐败材料应做反向血凝试验检验鼠疫F1抗原。

　　核酸检测：可按照《国境口岸鼠携带鼠疫菌和汉坦病毒快速检测方法》（SN/T2616-2010）要求对捕获鼠类进行核酸检测。

　　2、汉坦病毒

　　鼠肺抗原和血清抗体检测：免疫荧光法检测鼠肺汉坦病毒抗原，或可按照（SN/T2616-2010）用双抗原夹心ELISA检测鼠汉坦病毒抗体。

　　核酸检测和序列测定：对免疫荧光阳性鼠肺标本，可按照（SN/T2616-2010）进行核酸检测。

　　病毒分离：有条件的实验室可开展病毒分离，或送到中国检科院、广东局卫检实验室进行病毒分离。

　　（二）蚊类携带病原体检测

　　先检测蚊类携带黄病毒属和甲病毒属情况，检测结果若为阳性再通过检测确定具体携带病原体种类

　　黄病毒属和甲病毒属的检测，根据实验室仪器配置情况，使用RT-PCR方法检测，阳性样本送省局或广东局P3实验室或中国检科院进行病毒分离。

　　1、引物

　　黄病毒属引物：上游引物FlaP1： TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA下游引物FlaP2: GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC扩增长度为266bp。

　　甲病毒属引物：上游引物AlphaP3: TGGCGCTATGATGAAATCTGGAATGTT下游引物AlphaP4: TACGATGTTGTCGTCGCCGATGAA扩增长度为139bp。

　　2、反应体系：2×RT-PCR buffer 25μL，25×Enzyme mix2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板RNA 5μL，其余用无菌去离子水补足，总体积50 μL。

　　3、扩增条件：50℃ 30min，94℃ 2min，94℃30s， 55℃ 30s，72℃ 60s，35个循环。

　　4、结果判断：用2﹪的胶，PCR产物5μL电泳，扩增长度266bp为黄病毒属阳性，139bp为甲病毒属阳性。

　　八、后续工作

　　1、捕获的鼠类需进行鉴定、检蚤、解剖，并将取下的肝脾肺、血清送厦门国际旅行卫生保健中心检测鼠类汉坦病毒、鼠疫抗体。

　　2、捕获到的蚊类需进行计数、分类鉴定等，蚊类检测甲病毒属、黄病毒属，蜱类检测伯氏疏螺旋体等病原检测。

　　3、将捕获到的蠓类进行计数、分类鉴定等。

　　九、数据上报、整理:

　　1、数据上报按照厦门海关方案要求执行，注意收集病媒生物监测现场照片、捕获的病媒生物照片和标本照片。

　　2、完成调查后撰写相关的调查报告。

　　十、其它要求：

　　按厦门海关相关方案要求执行。

　　古雷港区病媒生物监测服务项目采购公告